汪张伟 徐婉清 查小明
摘 要：针对传统骨科用粘合材料粘合性能和生物相容性能较低的问题，提出一种新型骨科用粘合材料的制备，通过猪皮搭载拉伸实验和生物学评价试验对粘合材料的性能进行研究。结果表明：在温度37 ℃条件下养护12 h的样品（SFDG12），猪皮搭载拉伸强度为181.5 kPa，细胞存活率高于90%，对细胞的粘附、生长、迁移都有一定的促进作用，具有较好的粘合性能和生物相容性能，可在骨科中伤口愈合缓慢区域使用。
关键词：胶合材料；
骨科；
生物相容性；
细胞繁殖
中图分类号：TQ931;TQ431.4 文献标志码：A文章编号：1001-5922（2023）06-0030-04
Preparation and performance study of orthopedic medical adhesive materials
WANG Zhangwei 1，XU Wanqing 2，ZHA Xiaoming 1
（1.The First Clinical Medical College of Nanjing Medical University，Nanjing 210029，China;2.Medical College of Nantong University，Nantong 226001，Jiangsu China）
Abstract：In view of the low adhesion and biocompatibility of traditional orthopaedic medical adhesive materials，a new orthopaedic medical adhesive material was prepared.The properties of the adhesive material were studied by piggy skin loading tensile test and biological evaluation test.The results show that the tensile strength of pig skin is 181.5 kPa and the cell survival rate is higher than 90% after 12 hours of curing at 37 ℃，which can promote cell adhesion，growth and migration.It has good adhesion and biocompatibility，which can be used in orthopedic areas where wound healing is slow.
Key words：gluing materials;orthopedics;biocompatibility;cell reproduction
醫用胶合剂是目前较为常用的一种医学材料，在软组织和骨骼损伤这种恢复较慢的伤口中，发挥着重要的作用。但受现代医学技术的影响，目前临床所用的胶合剂存在胶合强度低和生物相容性较差的问题，使得医用胶合剂的应用受到了很大的限制。为了寻找性能更优的医用胶合剂，部分学者也进行了很多研究，如从材料出发，研究了丝素蛋白材料的生物相容性。结果表明，丝素蛋白制作的丝素凝胶和丝素支架溶血率均低于5%，对细胞形态不产生影响，具备较好的生物相容性[1]。通过对丝素蛋白的组成结构与理化性质进行研究，探讨了其在骨科损伤治疗中的应用[2]。基于此，本研究在以丝素蛋白为基底，设计并制备了骨科丝素蛋白－多巴胺－京尼平粘合剂，并对其性能进行研究，为骨科医用胶合剂的发展提供数据基础。
1 材料与方法
1.1 材料与设备
主要材料：羟基琥珀酰亚胺（ NHS）（AR），新素新材料；
1-乙基-3-（3-二甲氨丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC）（AR），源叶生物科技；
碳酸钠（AR），海之源化工；
蚕茧（标准品），先蚕丝绸生物科技；
体积分数75%乙醇，君雁药业；
盐酸多巴胺（AR），昊毅新材料科技；
京尼平（AR），华翔科洁生物技术；
PBS缓冲液（标准品），卡诺斯科技；
SBF模拟体液（pH=7.4），源叶生物科技。
主要设备：DHG101A-4电热鼓风干燥箱，苏珀仪器；
SHZ-D磁力搅拌器，凌科实业发展；
M16RS高速低温离心机，迈皋科学仪器；
ZY-9000M电子材料试验机，卓亚仪器。
1.2 试验方法
1.2.1 丝素蛋白溶液的制备
（1）将4.24 g碳酸钠溶入2 L去离子水，煮沸放入5 g去除了污染部分的蚕茧，继续煮沸并不断搅拌，时间为30 min；
（2）取出丝素后，放入装有2 L水的烧杯中，慢慢搅拌洗去丝素中的杂质，搅拌时间为20 min。倒去烧杯中溶液，取出丝素，完成清洗过程[3]；
（3）重复“步骤（2）”清洗过程3次，捞出洗净的丝素平铺在锡纸上，然后置于DHG101A-4型电热鼓风干燥箱中烘干，烘干温度为60 ℃。隔固定时间称重，丝素质量不发生改变即可认为丝素已经完全烘干；
（4）将2 g烘干后丝素填充在60 mL样品瓶底部，然后放入8 mL浓度为9.3 mol/L的溴化锂溶液，在DHG101A-4型电热鼓风干燥箱中进行溶解反应，反应温度和时间分别为60 ℃和4 h；
（5）将溶解后溶液放入透析袋中，放入SHZ-D型磁力搅拌器上，用去离子水慢慢搅拌透析2 d，在第1、4 h换一次水，然后间隔12 h换一次水。在搅拌时要注意不要让透析袋受到破坏；
（6）将透析完成后丝素置于M16RS型高速低温离心机内进行离心处理，除去不溶物质，离心转速、温度和时间分别为7 800 r/min、4 ℃和20 min。根据溶液澄清情况选择离心次数，待溶液完全澄清后，再次放入透析袋中；
（7）在聚乙二醇溶液中透析浓缩，得到丝素蛋白溶液（SF）。
1.2.2 粘合剂的制备
（1）将NHS和EDC放入制备的丝素蛋白溶液中，在冰浴条件中进行搅拌，搅拌时间为30 min。搅拌结束后按照丝素蛋白羧基∶多巴胺=6∶1的摩尔比放入盐酸多巴胺，继续搅拌1 h；
（2）将混合溶液继续放入透析袋中，放入冰箱中进行透析，透析温度和时间分别为4 ℃和1 d，得到丝素蛋白-多巴胺粘合剂；
（3）按照丝素蛋白羧基∶京尼平=1∶2的摩尔比加入京尼平溶液，避光搅拌30 min，得到丝素蛋白－多巴胺－京尼平粘合剂（SFDG）。
1.2.3 猪皮样品的制备
提前将猪皮样品制备成1 cm2大小，然后用10 μL粘合剂均匀覆涂在猪皮表面，然后将2片猪皮合在一起，用5 g砝码压制，使猪皮结合的更为紧密，压制时间为10 s，得到猪皮粘合样品[5]。将样品用纱布包裹后置于模拟体液溶液中，然后放入DHG101A-4型电热鼓风干燥箱中，在温度37 ℃条件下进行养护。将养护0 h的样品编号为SFDG0，养护12 h的样品编号SFDG12。
1.3 性能测试
1.3.1 粘合性能
用电子材料试验机对样品进行拉伸强度测试，表征粘合剂的粘合性能[6]。
1.3.2 体外降解性能
将待测样品冷冻干燥后，制备成5 mm3大小的正方体，并对制作的样品进行称重，按照浴比1∶100将样品放入模拟体液中进行降解（SBF模拟体液pH=7.4，Pronase E模拟体液质量浓度为10 mg/mL），每天更换降解液，隔天将样品捞出烘干称重[7-8]。
残留率表达式为[9]：
Rm=（Mdt/Mi）×100%（1）式中：Rm为降解率；
Mdt为相应天数后烘干后质量；
Mi为初始质量。
1.3.3 细胞存活率试验
将不同质量冷冻干燥后的样品粉末放入EP管，然后置于超净台上用紫外光照射，在照射时要注意每隔4 h摇晃一次样品，保证样品光照均匀，照射时间为24 h。在试验开始前，将样品在体积分数为75%的乙醇溶液中浸泡10 min，然后在M16RS型高速低温离心机的作用下进行离心处理，离心转速和时间分别为800 r/min和5 min。去掉上清液后用PBS溶液清洗3次，然后配制成不同含量的加药细胞培养基。将溶解后3T3小鼠成纤维细胞放入9 mL正常细胞培养基中，并用枪头轻轻吹打，使之混合均匀。将混合液置于高速低温离心机中进行离心处理，去除离心液后放入1 mL含待测样品的细胞培养液，混合均匀。用血球计数板计数法计算细胞含量。
1.3.4 细胞迁移试验
提前将6孔板上布满细胞，划痕并用PBS溶液清洗，去除刮下的细胞，放在相应浓度的加药培养基内，置于温度为37 ℃，5%的二氧化碳培养箱中培养，定时拍照取样。
2 结果与讨论
2.1 粘合性能评价
本研究制备的粘胶剂主要用于骨科，人体正常温度为37 ℃，通过猪皮搭载拉伸强度探究在该温度下粘胶剂的粘合性能，结果如图1所示。
从图1可以看出，在该温度条件下，养护时间在1 h内，SF的猪皮搭载拉伸强度约为1 kPa左右，随时间的延伸，猪皮搭载拉伸强度逐渐增加。当养护时间增加到9 h时，猪皮搭载拉伸强度随之增加到58.5 kPa，继续增加时间，猪皮搭载拉伸强度慢慢趋于平衡；
当时间达到12 h时，猪皮搭载拉伸强度可以达到66.5 kPa。研究发现，SF猪皮搭载拉伸强度是由SF的固化程度决定的[10-11]。当养护时间小于等于3 h时，SF在猪皮间以溶液的形式存在;养护时间达到5 h时，SF才开始慢慢的成膜，猪皮搭载拉伸强度随之提升。经过多巴胺和京尼平处理后，养护时间为12 h时，猪皮搭载拉伸强度达到181.5 kPa。结果表明，多巴胺、京尼平对提升SF的粘合强度产生了积极的作用。这是因为在SF体系内引入多巴胺后，二者产生反应，产物不溶于水，在儿茶酚基的作用下，粘合剂与粘合界面的连接性更强，因此猪皮搭载拉伸强度有所上升。而京尼平的加入使得SF分子作用力有所增加，进而对粘合剂的粘合强度有所增加[12]。养护时间为12 h时，猪皮搭载拉伸强度更好，因此后续试验主要对SFDG0（对照组）和SFDG12（试验组）进行研究。
2.2 体外降解性能评价
体外降解性能的是粘合剂生物学安全性的重要指标，为了探究本研究制备的粘合剂体外降解性，选择SFDG0样品和SFDG12样品，分别浸泡在SFB模拟体液和Pronase E模拟体液中，观察样品在模拟体液中的降解情况，结果如图2所示。
从图2可以看出，SFDG0样品在SFB模拟体液中浸泡2 d后，残留率约为93%，继续增加浸泡时间，样品几乎不再发生降解，样品残留率一直维持在90%左右。而在Pronase E模拟体液中，SFDG0样品2 d残留率约为87%，且降解率随浸泡时间的增加而下降；
30 d时，残留率约为51%。而SFDG12样品在SFB模拟体液中降解速率较慢，2 d时，样品残留率约为98%，继续增加浸泡时间，样品残留率慢慢下降；
当达到20 d后，样品降解达到平衡，继续增加浸泡时间，样品残留率几乎不再发生变化；
30 d样品残留率约为92%。SFDG12樣品在Pronase E模拟体液中降解速率较快，2 d残留率约为89%，继续增加浸泡时间，样品缓慢降解；
浸泡时间达到30 d时，样品残留率约为70%。通过对比可以发现，在同等条件下，SFDG12样品的残留率明显高于SFDG0样品，出现这个变化的主要原因在于，SFDG0样品养护时间较短，京尼平的交联作用还没有发挥出来，因此主要是SF降解在主导。而SFDG12样品中，受京尼平交联作用影响，可降解程度降低；
但整个粘合剂是以SF溶液为基底，因此粘合剂仍具备一定的可降解性能[13-14]。
通过以上分析可以发现，虽然粘合剂整体降解能力较低，但粘合剂的基底为多种必须氨基酸组成的SF溶液，这些氨基酸对细胞粘附产生了积极的作用。同时，受SF特殊结构的影响，粘合剂可帮助细胞与外界的物质交换，提供空间结构供细胞的增长，进而增加了细胞粘附性[15]。这些都说明本研究制备的粘合剂对细胞的粘附和生长都产生了积极的作用，可在骨科中伤口愈合缓慢区域使用。
2.3 细胞存活率评价
图3为粘合剂细胞存活率結果。
从图3可以看出，所有样品的细胞存活率均随样品使用浓度的减小而增加，当SF样品质量浓度为1.25 mg/mL时，细胞存活率约为98%。从这个变化看，SF自身的生物相容性较好。制作成SFDG粘合剂后，随样品质量浓度的降低，细胞存活率虽然有所降低，但还是保持了一个相对较高的值。且SFDG0样品的最高细胞存活率为95%，比SFDG12样品最高细胞存活率的93%高约2个百分点。这个变化说明样品在37 ℃环境下处理的时间越长，对细胞存活率反而产生一些不利影响。出现这个变化的主要原因：在温度处理的过程中，粘合剂内部元素结构发生了一些改变，生成了多巴醌和栀子蓝色素，降低了细胞存活率[16]。这也说明粘合剂样品生物相容性较好。
图4为DiO染色细胞状态结果。
从图4可以看出，加入京尼平后，细胞增殖较为明显，细胞膜包被完整，正常贴壁生长。但细胞增殖速度随温度养护时间的增加而降低，且分布比空白样品更为不均[17-18]。同时，观察细胞状形状可以发现，所有样品细胞整体皆表现出星形的扁平状。这些都说明本研究制备的胶合剂具备优良的生物相容性，可以应用于骨科治疗中。
2.4 细胞迁移评价
为了探究粘合剂是否对细胞的迁移性产生影响，选择细胞划痕试验进行验证，具体结果如图5所示。
从图5可以看出，2组试验在0 h时，均可以看见较为明显的、没有细胞残留的划痕。当养护时间增加到6 h时，2组试验的划痕边缘皆出现了模糊的情况；
当养护时间达到24 h时，2组样品的细胞已经完全铺在划痕上，基本看不到划痕的存在，且2组样品并未出现明显的区别[19]。这些变化都说明了本研究制备的SFDG12胶合剂对细胞的迁移不产生影响[20]。这也说明当本研究制备的骨科胶合剂在实际应用的过程中，不阻碍伤口附近细胞迁移和繁殖，对促进伤口愈合产生积极的影响。
3 结语
本试验制备的医用骨科粘合剂综合性能良好，不会对细胞的存活和迁移产生不利影响，可以在骨科创伤治疗中使用。
（1）在体内应用温度条件下（37 ℃），SFDG表现出较好的粘合性能，粘合性能高于临床纤维蛋白胶，证实了该胶合剂可以在人体温度条件下使用；
（2）SFGD胶合剂具备一定的可降解性能，SFDG12样品在Pronase E模拟体液中浸泡30 d后，残留率约为70%。通过分析可以发现，本研究制备的SFDG12粘合剂能促进细胞的粘附和生长，可在骨科中伤口愈合缓慢区域使用；
（3）质量浓度为1.25 mg/mL的SFDG12样品细胞存活率高于90%，细胞增殖较为明显，细胞膜包被完整，正常贴壁生长，形状为星形的扁平状；
（4）SFDG12胶合剂对细胞的迁移不产生影响，在骨科伤口愈合的过程中，不阻碍伤口附近细胞迁移和繁殖，对促进伤口愈合产生积极的影响。
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收稿日期：2023-01-16；
修回日期：2023-05-10
作者简介：汪张伟（1995-），男，硕士在读，住院医师，研究方向：外科学;E-mail：wangzhangwei1108@163.com。
通讯作者：查小明（1968-），男，医学博士，副教授，主任医师，研究方向：外科学;E-mail：zhaxm_nj@163.com。
引文格式：汪张伟，徐婉清，查小明.骨科用丝素蛋白粘合剂的制备及性能研究[J].粘接，2023，50（6）：30-33.
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